Механизм лечебного действия пиявок
В секрете слюны и кишечном содержимом медицинской пиявки (Hirudo medicinalis) имеется богатейший набор биологически активных веществ, которые обладают противотромботическим, тромболитическим, гипотензивным, иммуностимулирующим, аналгезирующим, репаративным, антигипоксическим лечебным эффектом. Пиявка действует, как биологически активная игла. После ее укуса в организме возникает каскад сложных химических реакций. Раздражение определенных рефлексогенных зон на поверхности тела также благоприятно действует на организм.
Слюнные железы медицинских пиявок (Hirudo Medicinalis) содержат антикоагулянт гирудин, ингибиторы трипсина и плазмина, химазина, субтилизина и нейтральных протеаз гранулоцитов, фактора Ха, калликреина. Выделены ферменты: гиалуронидаза, коллагеназа, триглицеридаза, холестеринэстераза и дестабилаза.
Способность секрета слюнных желез пиявки ингибировать тромбоцитарно-сосудистыми плазменный гемостаз необходима для извлечения пиявкой крови — единственный источник питания, а так же для поддержания жидкого состояния крови в кишечном канале пиявки, что служит непременным условием для ее дальнейшего переваривания экзо- и эндопептидазами. Действие фермента дестабилазы направлено на растворение сгустков стабилизированного фибрина, если они образовались в кишечном канале, так как у медицинских пиявок, в отличие от других видов пиявок, отсутствуют протеолитические, фибринолитические ферменты, способные растворять фибрин. Ингибиторы протеаз, присутствующие в секрете пиявок и в содержимом ее кишечного канала, ограничивают действие протеаз сосудистой стенки, замедляя переваривание насосанной крови. Липолитическая активность секрета пиявок необходима для метаболизма липидов крови.
Гирудин — полипептид, молекулярная масса 7000 Д, состоит из 65 аминокислотных остатков, ингибирует тромбин, блокирует превращение фибриногена в фибрин, тормозит агрегацию тромбоцитов, снижает активность факторов крови V, VIII, XIII, что способствует длительному кровоизвлечению как в период насыщения пиявкой, так и после. В организме гирудин не токсичен. В эксперименте не вызывал учащенного дыхания, пульса, изменения артериального давления и полностью выводился из организма с мочой через 3 часа. Гирудин блокирует тромбообразования как в крупных, так и в мелких сосудах, удлиняет время свертывания крови, протромбиновое время.
В Швейцарии фирмой Ciba-Geigy производится рекомбинантный гирудин, десульфатогирудин, который идентичен нативному гирудину. Применение гирудина и препаратов из него — перспективное направление в кардиологии, хирургии, травматологии и ортопедии.
Гиалуронидаза — фермент, принимающий участие в расщеплении гиалуроновой кислоты и увеличивающий проницаемость тканей, капилляров, что способствует лучшему проникновению в кровь секрета слюнных желез пиявки и другим гидролитическим реакциям расщепления кислых мукополисахаридов (Баскова И.П., Никонов Г.И., 1987).
Гистамино- и серотониноподобные вещества содержатся в секрете пиявки. В местах ее прикладывания характерна местная воспалительная реакция (краснота, отек), что можно отнести за счет воздействия гистамина и серотонина.
Бделлины — ингибиторы трипсина и плазмина способны ингибировать амидолитическую активность плазмина и трипсина. Они представляют собой полипептиды с молекулярной массой 7000 (группа А) и 5600 (группа В). Наряду с низкомолекулярными бделлинами, полученными из экстрактов цельных пиявок, обнаружена фракция ингибиторов трипсина и плазмина с молекулярной массой — 38000. Кроме молекулярных масс, бделлины групп А и В различаются еще по ряду признаков. Так, в составе бделлинов В не обнаружены такие аминокислоты, как пролин, метионин, изолейцин, фенилаланин и триптофан. Бделлины ингибируют амидолитическую активность трипсина, плазмина, а также акрозина, образуя с этими ферментами неактивный эквимолярный комплекс.
Соотношение гирудина и бделлинов в препаратах гирудина из цельных пиявок: 1 г препарата гирудина фирмы Medimpex (Венгрия) с активностью 270 ATU/мг содержит 230 мг бделлинов и 27 мг гирудина, а фирмы Serva (США) с активностью 3400 ATU/ мг — 300 мг гирудина и 75 мг бделлинов. Препарат гирудина, полученный по методу Марквардта, свободен от бделлинов.
Эглины — это группа полипептидов с молекулярной массой 6600-6800 D. Эглины ингибируют а-химотрипсин, субтилизин и нейтральные протеазы гранулоцитов человека, эластазу и катапсин G и образуют с этими протеазами прочные комплексные соединения с константами диссоциации — (2-3)х1010 М. При некоторых патологических состояниях организма человека (ревматоидный артрит, подагра, эмфизема легкого и др.) наблюдается повышение активности катапсинов в животных тканях, что связано с высвобождением ферментов из лизосом. Эластаза и катапсин G относятся к группе сериновых протеаз, активных в нейтральной среде. Эластаза, гидролизующая эластин, и катапсин G выделены из полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов и других клеток. Они расщепляют протеогликаны, коллаген и ряд других белков. В норме катапсины обособлены от внутриклеточных белков в лизосомах. При повреждении тканей, а также под влиянием ряда факторов (некоторых гормонов, токсинов, иммунных комплексов и др.) происходит выход катапсинов из клеток. Нейтральные протеазы гранулоцитов человека вовлекаются в деградацию ткани, растворимые протеазы активируют свертывающие и комплементарные факторы и, таким образом, повышают воспалительный ответ при различных патологических состояниях. Ингибиторы этих протеаз способны уменьшать воспалительный ответ. Биологическая ценность этих ингибиторов зависит от их способности блокировать активность лейкоцитарных протеаз, выделяемых при воспалениях.
Дестабилазный комплекс (ДК). Дестабилаза e-(g-Glu)-Lys — это фермент осуществляет свою фибриноли-тическую (тромболитическую) активность посредством гидролиза изопептидных связей, образуемых при стабилизации фибрина в присутствии фактора XII свертывания крови, обуславливая нетрадиционный механизм фибринолиза.
Дестабилаза при электрофорезе проявляется в виде трех полос, соответствующих белковым фракциям с ММ 12.3, 25 и 50 кДа, причем каждой из них сопутствует аналог простациклина, определяемый как 6-keto-PGFla. Учитывая поведение дестабилазы в водных и органических растворителях, было высказано предположение о мицеллярной природе этого соединения, т.е. способность к агрегированию дестабилазы в более крупные комплексы реализуется в компоновке мицеллы, способной менять свою пространственную ориентацию в зависимости от полярности растворителя.
Дестабилаза обладает высокой агрегационной способностью. В результате агрегирования мономеров дестабилазы образуется мицелла, способная менять свою пространственную ориентацию в зависимости от природы растворителя или контактирующего субстрата, экспонируя при этом или гидрофильную, или гидрофобную части своей структуры. В результате контакта с кровью мицеллярная структура дестабилазы связывает свободные гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови, образуя липосому, которая в водных растворителях проявляет активность всех компонентов ДК (т.е. дестабилазы, аналога простациклина, гирудина и ИК), тогда как в органических растворителях демонстрирует активность лишь дестабилазы и аналога простациклина. Мономерной формой липосо-мы является фракция ДК с мм 25 кДа.
Липосомальная природа ДК обеспечивает и важную физиологическую роль этого комплекса как универсального тромболитического агента: быстрое проникновение ДК через мембрану клетки, прикреп-ление за счет липидного компонента дестабилазы к поврежденному тромбу, медленного лизисфибриново-го сгустка за счет изопептидазной активности дестабилазы и препятствование дальнейшему тромбообразованию за счет блокады тромбина, калликреина плазмы крови, агрегации и адгезии тромбоцитов. Таким образом, природная липосома ДК является агентом, обеспечивающим как профилактическое противотромботическое, так и тромболитическое действие.
Секрет слюнных желез медицинских пиявок. При многократном отборе секрета в сочетании с интервалами голодания пиявок был получен секрет слюнных желез, полностью лишенный способности замедлять свертывание фибриногена тромбином, так называемый «неактивный» секрет, в отличие от «активного», обладающего высокой антитромбиновой активностью. Оказалось, что секрет слюнных желез пиявок, кроме антитромбиновой, проявляет антитриптическую активность, т.е. в состав секрета входят гирудин и бделлины. Активность эглинов обнаружена в крови, содержащейся в пищеварительном канале пиявки.
Секрет слюнных желез пиявок не влияет на внешний механизм свертывания крови, стимулированный тканевым тромбопластином, ни in vitro, ни in vivo. В то же время, добавленный к плазме, он удлиняет время ее рекальцификации в 2-3 раза. Секрет пиявок ингибирует контактную стадию свертывания крови, что показано in vitro при активации ее стеклянным порошком или декстран-сульфатом. При использовании хромогенного синтетического субстрата S-2302 выявлено зависимое от дозы снижение активности калликреина, образующегося в результате активации контактной стадии свертывания крови.
При использовании меченных 14С глицерин-триалата и холестерин-олеата обнаружена липолитическая активность секрета слюнных желез пиявок. Удельная липазная активность секрета составляет 8,15х10-9 нмоль свободной жирной кислоты на 1 мг белка за 1 ч, а холестерин-эстеразная — 3,16х10-9 .
Из секрета слюнных желез пиявок выделен новый фермент дестабилаза, гидролизующий изопептидные е-(g-глутамил)-лизиновые связи в стабилизированном фибрине. Чрезвычайная ценность и своевременность обнаружения такого фермента обусловлена тем, что к настоящему времени в литературе накоплены данные о широкой распространенности е-(g-глутамил)-лизиновых связей между различными белками, выполняющими в организме важные физиологические функции. Они обнаружены в структурных белках и мембранных белках тромбоцитов и эритроцитов. Так, известно, что они обеспечивают сшивание фибрина с а2-антиплазмином и фибронактином. Образование таких связей отмечено при ряде патологических состояний, например, при катаракте хрусталика.
При нарушении целостности кровеносных сосудов происходит активация внутреннего механизма свертывания крови, при более выраженном повреждении сосудистой стенки — активация внешнего механизма свертывания крови (посредством выброса тканевого тромбопластина). На отрицательно заряженной поверхности коллагена, субэндотелия, а также на поверхности активированных тромбоцитов происходит активация белков свертывания крови, и в первую очередь, фактора XII и прекалликреина. Завершающим этапом тромбообразования является образование тромбина с последующим превращением фибриногена в фибрин, являющийся основой тромба. Эволюционно сложившийся тип питания медицинской пиявки обеспечивает блокаду активации свертывания крови. Стратегия этого процесса физиологически оправдана, поскольку БАВ, продуцируемые медицинской пиявкой и выделяемые ею в кровоток при кровососании, ингибируют внутренний механизм свертывания крови на ранней стадии его активации. Секрет пиявок блокирует активность калликреина и фактора XII свертывания крови, а также связывает ионы кальция, в присутствии которых происходит активация фактора XI в фактор ХIа. Кроме того, секрет пиявок блокирует адгезию и агрегацию тромбоцитов.
Таким образом, происходит рациональное блокирование каскада свертывания крови на уровне первичного сигнала. Секрет пиявок не влияет на активацию внешнего механизма свертывания, обусловленного высвобождением тканевого тромбопластина в результате значительного повреждения сосудистой стенки. Если же происходит генерализованная активация системы свертывания крови и при этом генерируется значительное количество тромбина, независимо от блокады внутреннего механизма свертывания крови, секрет слюнных желез пиявок, благодаря наличию гирудина, ингибирует свертывающую активность тромбина. Допустим, что антипрокоагулянтного потенциала секрета пиявок недостаточно для предотвращения тромбообразования и фибриновый сгусток все же образовался. В этом случае вступает в действие дестабилаза — фермент секрета пиявок, обеспечивающий разрушение стабилизированного фибрина, т.е. имеет место система подстраховки одного противотромботического механизма другим.